张彦红　欧阳能太　徐军　钟南山

　　【摘要】　目的　探讨转录因子NF-κB在哮喘发病机制中的可能作用。方法　将豚鼠随机分为对照组8只，实验组24只（2、6、12 h时间点各8只），地塞米松处理组8只，在血液中单个核细胞和肺组织的细胞核提取物中，应用电泳迁移率实验和超迁移率实验检测NF-κB的激活水平和组成NF-κB的亚单位。结果　在卵蛋白致敏的豚鼠，诱喘后2 h，血中单个核细胞NF-κB的活性(244.1±2.4)与对照组（167.0±4.6)比较，差异有显著性（P<0.05）；6 h达到最高水平(294.7±3.2)。进一步利用超迁移率实验证实，p50和p65抗体均参与NF-κB的组成。在肺组织，诱喘后2 h NF-κB的活性为(176.0±4.0），与对照组（67.3±2.5）比较，差异有显著性(P<0.05）；6 h达到最高水平(282.3±6.8)。进一步利用超迁移率实验证实p50抗体参与。地塞米松干预后NF-κB活性(235.4±3.3；104.6±8.4)与实验组对照组（294.7±3.2；282.3±6.8）比较，差异均有显著性（P均<0.05）。结论　NF-κB参与了哮喘的发病过程，NF-κB的激活和持续的高水平表达提示，NF-κB可能通过调节参与哮喘发病机制中的重要炎症因子的表达，从而使淋巴细胞的激活增生，炎症细胞迁移到肺脏炎症部位的过程中起着关键作用。地塞米松抑制NF-κB的表达，可能由此抑制炎症因子的表达从而达到抗炎作用的。
　　【关键词】　哮喘;　豚鼠;　地塞米松

NF-κB activation and the inhibitory effect of dexamethasone in experimental asthmatic guinea pigs

ZHANG Yanhong, OUYANG Nengtai, XU Jun ,et al.
（Guangzhou Institute of Respiratory Diseases,Guangzhou 510120, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of NF-κB in pathogenesis of asthma. Methods　Electrophoresis mobility shift assay and supershift assay were used to analyze the expression of NF-κB activation and its components. Results　Nuclear extracts prepared from the thoracic blood mononuclear cells and the whole lung tissue, respectively in OVA-sensitized and challenged guinea pigs, both displayed stronger DNA-binding activity at 2 h timepoint (244.1±2.4; 176.0±4.0) comparing to the control (167.0±4.6; 67.3±2.5), and the activity peaked at 6 h timepoint (294.7±3.2; 282.3±6.8) and continued till 12 h timepoint (200.9±1.2; 110.8±1.0). The activated NF-κB contained p50.Dexamethasone suppressed the NF-κB activation (235.4±3.3; 104.6±8.4) in the the nuclear extracts of the Blood mononuclear cells and the lung tissue, respectively. Conclusions　This result showed that NF-κB were possibly through transcriptionally regulating the expression of many important inflammatory proteins. The dexamethasone could inhibit the activation of NF-κB in the allergic model, possibly through which the antiinflammatory action was exerted.
　　【Key words】　Asthma；　Guinea pig；　Dexamethasone

　　支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，许多细胞和炎症因子参与其中。研究发现，许多因子在哮喘患者中均有高水平的表达。在基因的表达过程中，转录因子在转录水平上的调控起着极其关键的作用。
　　NF-κB是一种参与许多炎症因子的表达调控的转录因子^［1］。我们的研究利用豚鼠制作哮喘模型，观察了NF-κB在其肺组织和血液中单个核细胞中的表达，并进行了糖皮质激素的干预处理，进一步了解NF-κB参与哮喘发病的过程。

材料与方法

　　一、材料
　　鸡卵蛋白购于美国Sigma公司，抗p65抗体和 抗p50抗体购于美国Santa Cruza公司，蛋白浓度测试试剂盒和电泳迁移率试剂盒分别购于美国BioRad 公司和美国Promega公司。豚鼠48只，均为雄性，体重250～300 g，购于北京医科大学动物中心。
　　二、豚鼠哮喘模型的制备和处理
　　哮喘模型的制备参照本实验室已建立的方法。将豚鼠随机分为实验组24只，腹腔注射10%的卵蛋白(OVA)1 ml，14 h后应用1%卵蛋白溶液诱喘，诱喘后2、6、12 h(每个时间点8只)分别于麻醉后心脏穿刺取血，置于含有抗凝剂的剂管中，混匀待行单个核细胞的分离；取出肺脏立即于液氮中冷冻后并储存于-70℃冰箱。待提取核蛋白。
　　对照组8只，腹腔注射同等量的生理盐水，饲养条件及取材方法同实验组。地塞米松处理组8只，在诱喘前10 min腹腔注射地塞米松(40 mg/kg)，分别于诱喘后6 h按同法进行取材。
　　三、单个核细胞（PBMC）分离
　　血液中单个核细胞的分离参考按常规方法进行。
　　四、核蛋白的提取
　　肺组织细胞核蛋白的提取^［2］和单个核细胞核蛋白的提取分别参照文献［3］进行，肺组织在液氮存在下研磨至粉末状后，同细胞的处理类似，经低温、低渗及破坏细胞膜（及核膜）试剂处理细胞后，高速离心（16 000 r/min），取含核蛋白的上清分装保存于-70℃备用。
　　五、标准曲线制作
　　以牛血清白蛋白制作标准曲线，参照试剂盒说明（Bradford法）测蛋白浓度。
　　六、电泳迁移率实验
　　标记探针序列如下：5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′，3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5′。应用［γ-³²P］ATP(北京亚辉公司)标记，在T₄多核苷酸激酶作用下进行，聚丙烯酰胺凝胶纯化后与适量核蛋白（10 μg）进行结合反应，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 3 h（在125 V电压下进行），80℃干胶后于-70℃下进行放射自显影，显影后利用凝胶分析系统（英国UVP公司）进行密度扫描，以扫描值作为NF-κB活性的量化值。超迁移率实验：于加入探针前先加入抗体适当量4℃下孵育30 min，其他步骤相同。
　　七、统计学处理
　　数据用均数±标准差表示，各组间比较利用方差分析和q检验，以P<0.05为差异有显著性。

结果

　　一、NF-κB在血中单个核细胞的激活情况
　　NF-κB的活性在诱发后2 h（244.1±2.4）升高，与对照组（167.0±4.6)比较差异有显著性（P<0.05）；6 h达到最高水平(294.7±3.2)，12 h有所降低(200.9±1.2，图1)，但高于对照组（P<0.05）。进一步利用超迁移率实验证实p50和 p65抗体均参与激活的NF-κB的组成（图2）。